Hur extraherar jag DNA av rostsvampar koloniserade på växtmaterial?
Detta beskriver ett förfarande för att extrahera DNA från rostarter svampar koloniserade på alla växtämnen.
Detta beskriver ett förfarande för att extrahera DNA från rostarter svampar koloniserade på alla växtämnen. Slutprodukten är en blandning av främst svamp-DNA och en liten mängd växt-DNA i en lösning som kan användas vid PCR-amplifiering. Tidigare erfarenhet av wet-lab förväntas. Anpassad från tillverkarens protokoll.
- 1Lägg till lysmatris C-rör 25-25 mg infekterad bladvävnad (tumstackstorlek) och 20-25 mg kiselgur (en skopa av en tandpetare)
- 2Placera prover i MP fastprep 24 homogenisator under 20-talet på hastighet 4.
- 3Tillsätt 600 μl genomisk lysbuffert med proteinas K. Snabbt, virvel för att blanda helt.
- 4Inkubera vid 60°C i 1 timme. Vänd var 15: e minut för att blanda.
- 5Låt svalna till rumstemperatur.
- 6Tillsätt 200 μl kloroform. Invertera för att blanda.
- 7Snurra med högsta hastighet i 10 minuter.
- 8Överför supernatanten (toppskiktet) till ett rent 1,5 ml rör. Kassera föregående rör.
- 9Tillsätt 50 μl DNA-strippningslösning. Invertera för att blanda.
- 10Inkubera vid 60°C i 1 timme.
- 11Placera snabbt på is i 5 minuter.
- 12Tillsätt 100 μl nederbördslösning. Invertera för att blanda. Om det inte bildas vit fällning, tillsätt 50 μL
- 13Snurra med högsta hastighet i 5 minuter.
- 14Utan att störa pelleten, överför supernatanten till ett rent 1,5 ml rör. Kassera föregående rör.
Om pelleten inte går i lösning på egen hand, inkuberas i 5 minuter vid 37°C. - 15Tillsätt 5 μl musslor glykogen och 500 μl isopropanol.
- 16Invertera minst 50 gånger för att blanda.
- 17Snurra med högsta hastighet i 10 minuter. Du kanske vill ordna rören i samma riktning så att pelleten alltid är på samma sida efter centrifugering.
- 18Det ska finnas en liten pellets längst ner. Häll av supernatanten, var mycket, mycket försiktig så att du inte lossar DNA-pelleten. Om det inte finns någon pellets måste du försöka extrahera det igen.
- 19Tillsätt 100 μl TE-buffert till pelleten. Om pelleten inte går i lösning på egen hand, inkuberas i 5 minuter vid 37°C.
- 20DNA-extraktion är klar. Du kanske vill utvärdera kvaliteten / kvantiteten av DNA på en agarosgel.
- För användning vid PCR: Förbered en 1:10 utspädning av DNA-extraktionen. Om det inte fungerar, prova 1: 100. För mycket DNA kan hindra PCR-reaktionen.
