Hur gör man cellodling?
Fråga med cellinjetillverkaren för att bestämma det ideala cellodlingsmediet för cellerna du använder.
Cellodling är ett komplext förfarande som endast professionella laboratoriearbetare kan utföra eftersom det kräver massor av speciell utbildning och utrustning. Processen innebär att man tar ett litet cellprov från en djurvävnad och uppmuntrar cellerna att föröka sig. Att använda aseptiska förfaranden, att välja den ideala kulturen och mediet och bibehålla cellerna i en vänlig miljö hjälper till att säkerställa god spridning. Professionella börjar med att ställa in sitt arbetsområde och sedan välja de bästa cellodlingsmaterialen för experimentet. Efter det är det viktigt att övervaka de nyodlade cellerna och subkulturera dem efter behov för att fortsätta processen.
Metod 1 av 3: förbereda ditt arbetsområde
- 1Ställ in ett aseptiskt arbetsområde och sterilisera din utrustning. Spraya ner din arbetsyta och insidan av din cellodlingshuva med en 70% sprit med desinfektionsmedel. Hypokloriter, fenoler och alkoholer används också ofta för att sterilisera utrustning i ett laboratorium, men kontrollera om det finns tillgängligt i ditt laboratorium.
- Ta bort eventuella främmande föremål från ditt arbetsområde för att minska röran. Förvara inte föremål i samma utrymme där du utför cellkulturer.
- Se till att lämna cellkulturfläkten påslagen. Stäng inte av den om inte huven inte kommer att användas under en längre tid.
- Fråga med en laboratoriehandledare om du har frågor om vad du ska använda för att sterilisera ditt arbetsområde.
- 2Tvätta händerna och ta på dig personlig skyddsutrustning. Använd en antibakteriell tvål och varmt vatten för att tvätta händerna. Ta sedan på dig handskar, en klänning, skyddsglasögon, en mask och annat som kräver personlig skyddsutrustning för ditt experiment.
- Se till att binda håret om det är långt så att det blir ur vägen.
- 3Sterilisera alla reagenser, lösningar eller andra media du använder. Detta kan innebära att man använder en autoklav eller ett sterilt filter. Kontrollera riktlinjerna för vilken typ av media du använder innan du försöker sterilisera det.
- Stäng kolven omedelbart efter sterilisering av mediet för att förhindra kontaminering.
Använd samma typ av substrat eller suspensionsmedium som du använde för den ursprungliga cellodlingen. - 4Följ sterila hanteringsrutiner för att förhindra kontaminering. Att förorena ditt cellmedium med kemiska eller biologiska ämnen kan förstöra experimentet. Kemiska föroreningar inkluderar tvättmedel, vatten, endotoxiner och föroreningar i cellodlingsmediet. Biologiska föroreningar inkluderar mögel, jäst, bakterier, virus och mycoplasma. För att hålla dessa föroreningar borta från ditt cellodlingsmedium, följ alltid aseptisk teknik.
- Till exempel är det bäst att använda en pipett för att överföra medium till din kolv eftersom att hälla mediet ökar risken för kontaminering.
Tips: Arbeta alltid långsamt och medvetet för att säkerställa att du behåller ett sterilt arbetsutrymme.
Metod 2 av 3: välja celler, odling och medium
- 1Välj lämplig cellinje för dina experiment. Du kan skaffa ett brett utbud av djurcellinjer från kommersiella eller ideella leverantörer. Kontrollera vilka typer av celler som är tillgängliga och välj den som passar bäst för ditt experiment. Se till att du väljer en högkvalitativ cellinje för att öka chanserna för ett framgångsrikt experiment. Några kriterier du kanske vill överväga är:
- Arten av cellen
- Funktionella egenskaper hos cellerna
- Oavsett om du kan behöva ändliga eller kontinuerliga cellinjer
- De perfekta tillväxtförhållandena och egenskaperna
- Oavsett om du behöver normala eller transformerade celler
Varning: Försök aldrig att odla celler från någon som arbetar i laboratoriet. Att oavsiktligt införa dessa celler tillbaka i personens kropp kan leda till en malign sjukdom.
- 2Gå med en vidhäftande kultur för de flesta celltyper. Vidhäftande kultur är ett konstgjort substrat som cellerna är skiktade på. Denna typ av odling fungerar bäst för de flesta djurceller eftersom de behöver ett substrat att vila på för spridning. Det är dock bäst att kontrollera specifikationerna för den cellinje du använder för att avgöra om du behöver denna typ av kultur.
- Efter att ha lagt ditt medium till celler i en vidhäftande kultur, titta på cellerna under ett mikroskop för att se om de har frigjorts från substratet. De kommer att spridas om de har släppts från substratet.
- 3Välj en suspensionskultur för celler som har anpassats till den. Med en suspension vilar cellerna inte på någonting. Istället är de fritt flytande i vätska, vilket kan göra det lättare att skala upp kulturen med tillsatt medium. Vissa cellinjer har specifikt modifierats för att användas i en suspension, så kontakta cellinjetillverkaren för att vara säker. Ett suspensionsmedium är också ett bra alternativ för celler som inte är självhäftande.
- Tänk på att du måste utföra dagliga cellräkningar om du använder en suspensionskultur.
Tänk på att du måste utföra dagliga cellräkningar om du använder en suspensionskultur. - 4Välj det odlingsmedium som passar bäst för dina celler. Det ideala odlingsmediet kommer att variera beroende på vilken typ av celler du använder. Fråga med cellinjetillverkaren för att bestämma det ideala cellodlingsmediet för cellerna du använder. Några vanliga typer inkluderar:
- Serum
- Basala medier
- Reducerat serummedium
- Serumfria medier
Metod 3 av 3: övervakning av cellerna
- 1Kontrollera ph- och co2-nivåerna i cellmediet. De medelhöga CO2-nivåerna hålls bäst mellan 4-10% för alla cellinjer. Mediets idealiska pH-nivå varierar dock beroende på vilken typ av celler du använder, så kontrollera alltid pH-nivån för din cellkultur. Fråga med cellinjetillverkaren för att få information om den idealiska pH-nivån, eller använd vanliga rekommenderade pH-nivåer för de typer av celler du använder.
- Till exempel växer däggdjursceller bäst med ett pH på 7,4, men insektceller växer bäst med ett pH på 6,2.
- 2Reglera temperaturen för att uppnå optimal miljö. Vissa celler trivs bara inom ett smalt temperaturintervall, medan andra celler kan trivas i ett bredare temperaturintervall. Tänk på vilken typ av celler du använder och justera omgivningstemperaturen där du håller cellerna på den perfekta nivån. Några vanliga temperaturrekommendationer inkluderar:
- Mänskliga celler och däggdjursceller - 36 till 37°C (97 till 37°C)
- Insektsceller - 27°C
- Fågelceller - 38,5°C (101, -16°C)
- Kallblodiga celler - 15 till 26°C (59 till 26°C)
Professionella börjar med att ställa in sitt arbetsområde och sedan välja de bästa cellodlingsmaterialen för experimentet. - 3Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer direkt efter att du startat en odling. En hemocytometer är en rutnätliknande lins som går över toppen av cellerna under ett mikroskop. Detta gör att du lättare kan räkna cellerna genom att bryta cellerna i kvadranter och andra mindre segment.
- Se till att registrera antalet celler i varje rutnät på hemocytometern så att du kan avgöra om cellerna multipliceras nästa gång du räknar dem.
Tips: Använd en klickare för att göra det lättare att hålla reda på antalet celler i kulturen.
- 4Subkulturera cellerna när de har fördubblats. Efter att cellerna i mediet har fördubblats i antal kan du subkulturera dem för att fortsätta tillväxten genom att dela cellerna i två behållare och lägga till färskt medium till var och en. Använd samma typ av substrat eller suspensionsmedium som du använde för den ursprungliga cellodlingen.
- Dela cellerna i två kolvar så att hälften är i var och en, tillsätt sedan 3 delar nytt medium i behållaren så att mediet är 25% gammalt och 75% nytt.
- Tvål
- Handskar
- Klänning
- Mask
- Cellodlingshuva
- Desinfektionsmedel
- Cell kultur
- Cellodlingsmedium
- Celllinje
- Pipetter
- Mikroskop
- Hemocytometer
- Clicker (för att räkna celler)
Läs också: Hur beräknar jag RPM?
